PCR

i-pfu DNA Polymerase

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PRODUCT INFORMATION
Description

높은 정확성을 요하는 gene cloning에 꼭 필요한 Proof-reading 기능을 가지며 낮은 에러율을 보이는 고순도의 pfu DNA Polymerase의
PCR core Kit

  • • 높은 정확성
       - Proof-reading 활성이 있어 장편의 DNA template 증폭 가능
       - 유전자 cloning 및 발현과 같은 정확성을 요구하는 실험에 최적
  • • 낮은 error rate
       - 3’→5’ exonuclease 활성이 있는 대표적인 내열성의 proof-reading 효소로서 1x10-6의 error rate를 가짐
  • • Blunt-end Cloning 가능

i-pfu DNA Polymerase는 3’→5’ exonuclease 활성이 있는 대표적인 내열성의 Proof-reading 효소로서, 높은 fidelity를 가지고 있으며 1x10-6(13,000 base pair당 한 개의 error rate)의 error rate를 보장하는 제품입니다. pfu DNA Polymerase가 가지는 proof-reading 활성은, DNA Polymerase가 중합반응을 진행하는 중에 mismatched(상보적이지 않은) nucleotide가 끼어든 경우 이를 제거하고 상보적인 nucleotide로 교정할 수 있다는 것입니다. 이러한 활성은 Taq DNA Polymerase
보다 더 정확한 염기서열의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 하기도 하지만, Taq DNA Polymerase에 비하여 더 긴 DNA template를 증폭할 수 있도록 해줍니다.

DNA 합성과정 중 DNA Polymerase가 template로부터 떨어져 나오게 되는 가장 큰 원인이 mismatched nucleotide가 중합반응을 방해하기 때문인데, Pfu DNA Polymerase의 경우 이를 제거할 수 있기 때문에 중합반응을 계속할 수 있게 되며, 일반적인 Taq으로는 증폭이 어려운 긴 size 의 PCR(up to ~ 30 kb)에 적합한 효소로 일반 Taq DNA Polymerase에 비해 높은 fidelity와 proof reading 기능을 가지고 있습니다.

그 결과 Taq DNA Polymerase보다 더 긴 DNA fragment (최대 30kb)를 증폭할 수 있는 것입니다. 이런 특성 때문에 Pfu DNA Polymerase가 중합효율이 떨어져
중합에 더 많은 시간을 필요로 함에도 불구하고 유전자 cloning 및 발현과 같이 정확성이 요구되는 실험에는 널리 이용되고 있습니다. 이러한 i-pfu DNA Polymerase는 Taq DNA Polymerase와는 달리 blunt-end의 증폭산물을 만듭니다. 따라서 증폭산물을 클로닝하기 위해서는 blunt-end를 갖는 vector에 클로닝 할 수 있으며
T vector 클로닝 하기 위해서는 염기 A를 부가적으로 붙여 주어야 합니다.

Applications
  • 01General PCR
  • 02염기서열 분석을 위한 template 증폭
  • 03Blunt Cloning, etc.
Kit Contents
Content 250 Units
i-pfu DNA Polymerase(2.5U/ul) 250 units x 1 tube
10× PCR Buffer(w/15 mM Mg2+) 1 ml x 1 tube
10× Mg2+ free PCR Buffer 1 ml x 1 tube
10 mM dNTPs (2.5 mM/each) 500 ul x 1 tube
25 mM Mg2+ 1 ml x 1 tube
Manual 1 ea

참고. 10x i-pfu PCR Buffer

Technical Data

민감도 비교 test 결과(타사비교)

i-pfu DNA Polymeras와 Company A, B 사의 동일 기능의 제품을 이용하여 민감도를 비교하 기 위하여 1 Kb와 4.5 Kb fragment primer로 template 농도 별 희석하여 증폭한 결과입니다. i-pfu DNA Polymeras가 타사 동일 기능의 제품에 비하여 좀 더 낮은 template 농도에서도 뛰어난 민감도를 보여주고 있음을 볼 수 있습니다.

[ Panel A ] 1 Kb amplification(λDNA)
Lane M, 1 Kb DNA Ladder; lane 1, 200 pg λDNA; lane 2, 100 pg λDNA; lane 3, 50 pg λDNA; lane 4, 25 pg λDNA; lane 5, 12.5 pg λDNA; lane 6, 6.25 pg λDNA; lane 7, 3.125 pg λDNA; lane N, negative control

[ Panel B ] 4.5 Kb amplification(TopoXL/5F)
Lane M, 1 Kb DNA Ladder; lane 1, 50 ng DNA; lane 2, 10 ng DNA; lane 3, 2 ng DNA; lane 4, 400 fg DNA; lane 5, 80 fg DNA; lane 6, 16 fg DNA; lane 7, 3.2 fg DNA; lane N, negative control

TroubleShooting Guide
Q실험을 하기 위해 메뉴얼을 보니 reaction volume이 50ul일 때 실험법만 나와 있습니다. 20ul로 volume을 변경하려는데 taq을 얼마나
넣으면 되나요?
APCR reaction volume이 50ul에서 20ul로 줄이더라도 같은 양의 Taq을 넣어주면 됩니다. template, primer등 동일한 양을 넣어 실험하면 됩니다. 단지 달라지는 것은 10X PCR buffer를 5ul 넣지 마시고 2ul 로 줄여서 사용하시기 바랍니다.
Q현재 full genomic seqeuncing을 수행중인데 PCR시 mutation이 있으면 반응진행이 안됩니다. fidelity가 높은 제품이 있나요?
A당사의 i-pfu의 경우 error rate은 1X10-6이며, 최대 10kb까지 증폭이 가능합니다. 더 높은 기능이 함유된 제품을 원하신다면, error rate이 1.8X10-8이고 20kb까지 합성 가능한 i-StarMAXII™ 제품을 추천 드립니다.
QHIV의 mutagenesis 연구 중입니다. point mutation 실험하려고 하는데, kit화된 제품은 가격이 비싸고 enzyme만 구매하고 싶은데
적합한 제품이 있습니까?
Ai-pfu™ DNA polymerase를 추천드립니다. i-pfu DNA polymerase는 proof-reading 활성을 가지고 있어 PCR 반응 중에 mutation
발생 비율을 낮추어 줍니다.
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