Description

3 step으로 원하는 위치에 대한 돌연변이 유도 및 돌연변이 연구용 제품

• • 최적화된 protocol로 전문가는 물론 비전문가도 손쉽게 사용 가능
• • 2일(3 steps) 만에 원하는 부위에만 돌연변이 유도 가능
• • Muta-Direct™ 및 Mutazyme™ 효소 사용에 의한 편리성
• • Point mutation, deletion, Insertion 등 다양한 돌연변이 유도
• • 이론상 돌연변이 유도 100%
• • 저렴한 비용으로 돌연변이 실험 가능

Muta-Direct™ Site-Directed Mutagenesis Kit는 plasmid DNA에 cloning 되어 있는 유전자의 원하는 부위에 돌연변이를 유도 시키는데 사용되는 제품으로써 이론상 100%의 돌연변이 유발률 (efficiency)을 보이며, 더불어 2일 정도의 실험으로 모든 단계가 마무리되는 매우 간편하면서도 편리한 제품입니다. M13 등과 같은 특별한 vector의 사용이나 DNA methylation 단계가 없이 고객이 원하는 부위만을 특이적으로 돌연변이를 유도할 수 있도록 고안된 제품입니다.
위치 특이적 돌연변이 (Site-directed mutagenesis)란 특정 DNA 염기서열을 변화시킴을 의미합니다. 이는 어떤 단백질의 기능 부위를 연구할 때에 특정 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환, 삽입, 혹은 제거한 다음에 단백질의 기능 변화를 관찰함으로써 기능 부위 (functional site; catalytic domain)를 규명하고자 할 때도 사용될 수 있으며, DNA 클로닝 시에 사용할 제한효소 절단 부위를 만들거나 소실시킬 때 사용되기도 합니다. 또한, promotor 나 enhancer 연구에서 어떤 요소 (factor)가
결합하여 기능하는지를 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화시켜서 결합을 못 하게 한 다음 promotor 나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 요소의 중요성을 조사할 수도 있습니다.

Muta-Direct™ Site-Directed Mutagenesis Kit는 전문가가 아닌 비전문가의 경우에도 간편하게 돌연변이를 유도할 수 있도록 가장 최적화된 Protocol (Technical Data 참조)을 제공하고 있을 뿐만 아니라 저렴한 비용으로 실험을 가능케 하고 있습니다.

Applications

• 01원하는 nucleotide의 변이유도
• 02Mutation clone의 wild type으로의 재변이 유도
• 03nucleotide Insertion, deletion
  유도
• 04유전자 및 단백질의 기능분석 (Genomics/Proteomics)
• 05유전자에 돌연변이 유도에 의한 단백질 성능 개선 및 생산성 증대 등 Protein engineering 분야

Kit Contents

Muta-Direct™ 사용 방법

1. 원하는 특정 부위의 돌연변이를 위한 primer 제작 (Protocol의 primer design 참조)
2. Muta-Direct™ enzyme을 이용하여 PCR 증폭 (15~18 cycle)
3. Mutazyme™ 처리에 의해 mutation clone 획득
4. E.coli에 Transfection 진행
5. 특정 항생제가 포함된 LB plate에 spreading (이론상 형성된 clone은 100% 돌연변이가 유도된 clone임)
6. 염기서열 분석을 통해 mutation 최종 확인

Muta-Direct™ 사용 Tip

1. Primer design : Primer size는 25~45 mer 이내로 하며 30~35 mer를 권장합니다. 중요한 것은 변이를 일으키고자 하는 nucleotide가
   primer의 가운데 위치하도록 하여 30 mer로 일단 디자인하여 아래의 Tm 값이 78℃ 이상 (GC%가 최소 40% 이상)이 되는지 확인합니다.
   Tm값이 78℃ 이상이 안 되는 경우 primer size를 늘리거나 줄이도록 합니다.

     1) 서로 상보적인 sequence를 갖도록 forward 및 reverse primer를 디자인하는데, 이때 원하는 mutation site가 primer의 가운데에
         위치하도록 합니다.
     2) 30 mer를 디자인하여 Tm값이 78℃ 이상이 되는지 확인하고, 이하인 경우 primer size를 증가하여 78℃ 이상 되도록 합니다.
     3) Primer는 desalting grade를 사용치 말고, 최소 FPLC 또는 OPC 정제 순도 이상을 사용토록 합니다.

2. Tm 계산 공식: Tm = 0.41(GC %) - 675/L + 81.5
     1) L : Primer의 oligomer 수
     2) GC % : Primer GC 염기의 %

3. Primer design의 예시: 다음은 Primer design의 예시로써, GCG → ACG로 바꾸는 경우입니다.
   5' - CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG - 3'
     1) 변이를 유발하고자 하는 “A (or T)” 가 가운데 위치하도록 하여 forward 및 reverse primer를 각각 30mer씩을 디자인합니다.
         forward Primer : 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
         reverse Primer : 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
     2) 상기 primer GC %=40과 L=30이며, 이를 상기 Tm 계산공식에 넣어 계산해 보면 Tm = 0.41*40 - 675/30 + 81.5 = 75.5℃가 되어 78℃
         이하가 되므로 적절한 primer가 아닙니다.
     3) 이러한 경우 primer size를 증감하는데
         forward Primer : 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
         reverse Primer : 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
         위 예시의 경우 5 mer 정도를 증가시킨 경우로 GC %=45.7과 L=35가 되고 이를 공식에 넣어 보면,
         Tm = 0.41*45.7 - 675/35 + 81.5 = 80.952℃로 Tm이 78℃ 이상이 되어 적절한 primer가 될 수 있음을 알 수 있습니다.

Mutation 실험 예시